Curs 2009-2010

Llicenciatura en Biologia

Biologia Estructural (12307)

IDENTIFICACIÓ DE L'ASSIGNATURA
L'assignatura Biologia Estructural és una matèria obligatòria del currículum de Biologia Humana que s'imparteix al tercer trimestre del tercer curs. Consta de 3 crèdits teòrics i de 6,5 crèdits pràctics.

COORDINACIÓ I PROFESSORAT
El coordinador de l'assignatura és el Dr. Baldomero Oliva. Els doctors Nuria Centeno-Boada, Jordi Villà i Jana Selent participaran en la docència.

OBJECTIUS GENERALS
Amb aquesta assignatura es pretén que l'alumne adquireixi coneixements pràctics i teòrics sobre l'estructura proteica i de les biomacromolècules, així com dels mètodes emprats per al seu estudi i caracterització. La matèria que integrarà el present curs comprèn:
- La introducció a les bases biofísiques de sistemes moleculars.
- Els principis estructurals dels biopolímers: proteïnes i DNA.
- La determinació de l'estructura tridimensional de biomolècules.
- La relació estructura/funció de les proteïnes.
- La simulació molecular de proteïnes i DNA.

AVALUACIÓ DELS APRENENTATGES
L'avaluació del rendiment acadèmic es farà segons el barem següent (sobre un total de 10 punts):
Preguntes d'elecció múltiple: 1,5 punts
Preguntes d'assaig: 2,5 punts
Examen de pràctiques: 3 punts
Treball de presentació: 3 punts
Qualsevol tipus de còpia dels apartats d'avaluació implica la no-superació de l'assignatura.
S'exigeix un mínim de 1/3 de la puntuació de pràctiques i aprovar cada una de les altres parts per poder aprovar l'assignatura (0.8 de PEM, 1.25 d'assaig, 1.5 del treball i 1.5 de les pràctiques).

REQUERIMENTS
És necessari tenir un coneixement previ de l'assignatura Matemàtiques i Física dels Processos Biològics, impartida durant el primer curs, així com de les assignatures Química Analítica i Farmacèutica i Anàlisi de Drogues i de Medicaments i Bioinformàtica, que s'imparteixen al quart curs de la llicenciatura.

TEMARI TEÒRIC
PART I: INTRODUCCIÓ
Tema 1. Nocions bàsiques de mecànica clàssica i estadística
Conceptes bàsics de mecànica clàssica: forces i energies. Camp de potencial energètic per biomolècules. Conceptes bàsics de mecànica estadística. L'espai de fase, l'espai conformacional i la funció de partició. Entropia (S), entalpia (H) i energia lliure (G).

PART II: PRINCIPI ESTRUCTURAL
Tema 2. Proteïnes: cadena polipeptídica, estructura secundària, terciària i quaternària
Seqüència i informació codificada. Blocs conservadors de residus. Homologia i relació seqüencial. Entropia i solvatació. Efecte de clatració i entropia del medi solvent. Principis generals de plegament de proteïnes globulars: nucli hodrofòbic i elements d'estructura secundària. L'espai de Ramachandran. L'hèlix alfa i el full beta. Estructura supersecundària i connexions d'estructures secundàries (llaços). Empaquetament d'alfa-hèlixs. Els dominis tot alfa. Dominis a/b: el plegament Rossmann i el barril TIM. Dominis a+b. Dominis tot beta: barril l super-barril de b meandres, el sandvitx greek-key i el jelly-roll.

PART III: DETERMINACIÓ DE L'ESTRUCTURA
Tema 3. Cristal·lografia de proteïnes i difracció de raigs X
Nocions de mecànica ondulatòria. El principi de la superposició d'ones. Sèries de Fourier i la transformada de Fourier. Difracció de raigs X en cristalls. Expressió de la intensitat de reflexió. La llei de Bragg. Mapes de densitat electrònica. Factors tèrmics i estructurals de vibració. El problema de les fases. Reemplaçament isomorf únic i múltiple difracció anòmala. Refinament estructural i reemplaçament molecular. Microscòpia electrònica d'alta resolució (HREM). Combinació de mètodes experimentals: HREM + X-ray. Espectres de massa.

Tema 4. Ressonància magnètica nuclear
El fenomen de la relaxació i l'espín. La ressonància magnètica nuclear: la inducció nuclear, el camp pulsat de radiofreqüència (RF) i el free-induction decay (FID). Nuclear Overhauser Enhancement (NOE). Espectroscòpia de RMN bidimensional. Determinació de l'estructura tridimensional de proteïnes i àcids nucleics mitjançant restriccions de distància.

Tema 5. Mètodes teòrics (Modelatge Comparatiu i Threading)
La classificació de proteïnes i les relacions evolutives de la seqüència. Mètodes de superposició d'estructures terciàries. Definició de l'estructura secundària. Caracterització dels centres actius i centres funcionals. Models ocults de Markov. Xarxes neuronals i predicció d'estructura secundària. Modelatge comparatiu de proteïnes. Teorema del plegament invers. Mètodes de predicció de plegament i threading. Mètodes ab initio i mini-threading.

PART IV: ESTRUCTURA/FUNCIÓ

Presentació dels treballs sobre:

Estructura del DNA i RNA
La doble hèlix de DNA. Els solcs major i menor de la doble hèlix. Formes B, A i Z de DNA. La triple hèlix de DNA. Reconeixement de bases de DNA. El nucleosoma i la heterocromatina. Estructura de t-RNA. Estructura de la RNAsaP. Estructura del Ribozima. Predicció de l'estructura secundaria de RNA.

Reconeixement del DNA. Factors de transcripció
Estructura del "lambda Cro" i la seva interacció amb DNA: predicció per modelatge de la interacció. Motius helix-turn-helix, zinc-fingers i leucine-zippers. La transcripció del DNA i els factors de transcripció: famílies amb motius zinc-finger. Homeodominis. Leucine-zippers.

Maquinària de replicació: DNA polimerases, helicases, topoisomerases, etc.
Replicació del DNA. Estructura de la DNA polimerasa I i del fragment Klenow. Estructura d'alguns enzims de restricció i proteïnes estabilitzadores de la cadena senzilla de DNA (SSB). Topoisomerases tipus I i tipus II i l'alliberació de l'estrès torsional del DNA. Transcriptasa inversa. La recombinació del DNA: complex RuvA-RuvB-Holliday junction.

Maquinària de traducció: RNA polimerasa, Aa-t-RNA sintetasa, el ribosoma
Estructura de la RNA polimerasa de E. coli. Estructura de les aminoacil-tRNA sintetases: el domini catalític i el domini que identifica l'anticodó. El ribosoma: subunitats 30S i 50S del ribosoma procariota. Encaixament de les proteïnes del ribosoma en l'estructura de la seqüència 16S de rRNA. La combinació de la difracció de raigs X i la microscòpia electrònica d'alta resolució.

Enzims amb motius d'unió a nucleòtid
Els processos d'oxidoreducció i els grups prostètics nucleotídics NAD, FAD i FMN. El domini d'unió de NAD: el plegament de Rossmann i la hipòtesi de Rossmann. Transferència estreoespecífica del protó de NADH. El motiu d'unió de nucleòtid NAD-binding. Fusió de gens entre el motiu FMN-binding del barril a/b i el citocrom b5. Els motius Walker A i B. Quinases: CDK, MAPK, Tyr-quinases i Ser-quinases.

Exemples d'enzims catalítics: proteases
La catalització mitjançant enzims. L'estat de transició, el centre actiu i l'encaixament enzim-substrat. Centres específics d'unió a substrat (subsites). Les serin-proteases: aminoàcids de la tríade catalítica i de l'oxyanion hole. Metal·loproteases: carboxipeptidases.

Proteïnes del sistema immunitari
Recombinació somàtica implicada en la varietat dels anticossos. Dominis conservats i variables i les regions determinants de la complementarietat. El complex antigen-anticòs. Estructura dels complexos d'histocompatibilitat (MHC): human lymphocyte antigen (HLA). Polimorfismes de la cadena pesada de MHC de classe I.

Proteïnes de membrana
Dificultats en la cristal·lització de les proteïnes de membrana. Hèlixs transmembrana i gràfics d'hidropaticitat de l'estructura primària. Bacteriorodopsina. Centre de reacció fotosintètica de Rhodopseudomonas viridis. Reacció de fotosíntesi, transferència d'energia i efecte túnel. Estructura de les proteïnes b-transmembrana: porines.

Famílies de receptors i proteïnes G
Proteïnes G i receptors de factors de creixement. El factor de creixement epidèrmic (EGF) i el seu receptor. L'oncogèn v-erb B. Els receptors d'insulina, EGF i PDGF. Transducció del senyal: tirosina-quinases. L'amplificació del senyal. Estructura de l'adenilat ciclasa. Estructura d'una forma truncada de ras p21 (cH-ras p21). El motiu d'unió a GTP: mutacions implicades en l'activació oncogènica.

Encaixament proteïna-proteïna, proteïna-DNA
Comparació complementària de superfícies. Programes automàtics d'encaixament proteïna-proteïna i proteïna-DNA. Combinació dels mètodes d'encaixament rígid de molècules i de mètodes de simulació molecular.

Estructura del RNA
Tipus d'enllaços , empaquetament i ponts d'hidrogen. Estructura secundaria. Predicció de l'estructura secundaria. Estructura del t-RNA: El T-loop i els U-turns. Ubicació de l'anticodó. Formacions d'hibrids. Estructura del Ribozima. Estructura de la RNAsa P.

Capsides de virus
Simetría icosaédrica del virus esférics. Utilització de més d' una cadena polipeptídica en un virus complexe. La cápside del picorna virus. Virus animals i vegetals.

Spliceosoma
Components U1. snRNA. snRNP U1A. Unitat de l'anell Sm. Proteina C. Factors auxiliars A2F. Estructura del U2 i U5

Xaperones
Plegament ajudat per proteines. Hsp 60, Hsp70 , Hsp 90, Hsp100, GroEL i GroES. Dominis d'unió a ATP.

Sistema d'ubiquitinació. Proteosoma
Sistema d'ubiquitinació i eliminació de proteines desplegades. Estructura del proteosoma. Estructura de les Ubiquitines i dels ring finger. Formació de complexos.

Nucleosoma
mpaquetament del DNA.Heterocromatina. Histones H1, H2, H3 i H4.

PART V: SIMULACIÓ MOLECULAR
Tema 7. Simulacions de metròpolis Monte Carlo i dinàmica molecular
Camps de força moleculars. Algoritmes de diferències finites (Verlet). Simulació per metròpolis Monte Carlo. Simulated Annealing. Efecte del solvent en simulacions de proteïnes. Condicions de contorn i tractament del camp electrostàtic.

Tema 8. El camí del plegament
El problema del plegament i la paradoxa de Levinthal. Aplicació dels models de lattice. Simulació de desplegament. Restriccions definides pels estats de transició de plegament obtinguts per mutagènesi dirigida (funcions f).

TEMARI PRÀCTIC
El programa teòric es complementa amb les pràctiques següents (sessions de dues hores):

Pràctica 1. Introducció a Linux i als programes gràfics
Iniciació a Linux: comandes principals, espais de disc. Primer contacte amb els programes gràfics: RasMol, Chime.

Pràctica 2. Caracterització de motius i estructura secundària
Ús del DSSP i dels programes de visualització en cintes. Caracterització de motius d'estructura supersecundària (b-hairpin, a-hairpin, b-a-b). Càlculs de superfície i visualització mitjançant Rasmol, Chime, Grasp, MolMol, PyMOL, Molscript. Estudi dels tipus de plegament: tot alfa, tot beta, alfa/beta i alfa+beta.

Pràctica 3. Alineament de seqüències i cerca d'homologia remota
Part 1: Alineaments múltiples mitjançant ClustalW. Position Specific Substitution Matrix (PSSM). Mètode de cerca mitjançant Psi-Blast.
Part 2: Models ocults de Markov (HMMER). Bases de dades PFAM.

Pràctica 4. Superposició estructural i caracterització de plegaments
Part 1: Superposició de proteïnes dirigida i càlcul de RMSD.
Part 2: Caracterització del tipus de plegament de diverses estructures problema utilitzant els programes d'alineament estructural (CE, SSAP, STAMP) i els programes gràfics. Estudi detallat de SCOP, CATH i DALI. Superposició d'estructures.

Pràctica 5. Modelatge comparatiu
Part 1: Cerca de proteïnes homòlogues a la proteïna problema i alineament múltiple per ClustalW.
Part 2: Alineament estructural de les proteïnes homòlogues. Alineament múltiple per Hidden Markov.
Part 3: Modelatge mitjançant MODELLER.
Part 4: Comparació estructural i caracterització del model entre les estructures homòlogues amb les quals aquest es va generar. (PROCHECK)

Pràctica 6. Predicció estructural (ab initio i threading ) i valoració de l'estructura
Part 1: Anàlisi de potencial estadístic mitjançant Prosa II.
Part 2: Predicció d'estructura secundària per Internet i mètodes de predicció mitjançant Machine Learning (Psi-Pred). Estudi predictiu de l'estructura d'una proteïna mitjançant algoritmes de plegament invers, threading i predicció 3D ab initio. Utilització de FUGUE i 3DPSSM a Internet.
Part 3: Estudi estructural del model generat a la pràctica 5 mitjançant Prosall i la comparació d'estructura secundària. Comparació amb resultats de threading.

Pràctica 7. Simulació per dinàmica molecular
Part 1: Estudi del sistema (proteïna) construcció de la topologia i optmització de l'estructura.
Part 2: Aplicació de dinàmica molecular. Estudi del model dissenyat a la pràctica 5.
Part 3: Anàlisi de la trajectòria: fluctuacions, RMSD, superfícies i ponts d'hidrogen.

Pràctica 8. Encaix de proteïnes
Aplicació del programa FTDOCK per a la complementarietat de superfície entre l'inhibidor natural de carboxipeptidasa i la carboxipeptidasa.

Pràctica 9. Reactivitat enzimàtica
Part 1: Aplicació de MOLARIS. Estudi del sistema, definició de residus clau i coordenades de reacció.
Part 2: Superfície potencial, estats de transició i intermedis de reacció. Comparació de la reactivitat en aigua i caracterització de la reacció enzimàtica.

TREBALL PRÀCTIC
Aquest treball s'ha de fer per grups de 4/5 estudiants i presentar-lo mitjançant HTML i de forma auto-explicativa. El treball es podrà escollir amb una única opció, canviable quan sigui possible, entre les següents:
1) Un programa de càlcul de freqüències d'interacció entre residus i valoració energètica d'un model per a pseudopotencials.
Els potencials estadístics s'han convertit en una de les principals eines de la predicció/validació d'estructures tridimensionals. Aquests potencials es basen en freqüències d'interacció, de manera que la major dificultat d'aquest programa és extreure el major profit de totes les dades estructurals. Aquest programa s'aplicarà al model construït i es valorarà tant el model com el mateix programa. La realització del programa serà tutelada.

2) Cerca de patrons 3D d'unió a grups prostètics

Unió a cofactors (NAD, FAD, FMN)
Unió a metalls (Zn, Ca, Mg, FE)
Unió a substrats petits (GTP, ATP)
Unió a macromolècules: DNA, RNA
Unió a lípids
Unió a glúcids

3) Estudi de la interacció proteïna-proteïna

Comprovació de la conservació dels residus en la interacció.
Estudi de la disposició 3D entre dominis i dels linkers.
Anàlisi del camp de forces en la interacció i en la superfície.
Superposició estructural i generació de patrons comparatius entre complexos de proteïnes i dominis de proteïnes.
Caracterització estructural de les interaccions i la reactivitat en les cascades de fosforilació.

4) Estudi estructural comparatiu de l'estructura del ribosoma (tema 9). Anàlisi topològica
Estudi bibliogràfic acompanyat de l'anàlisi computacional. Caracterització de les interaccions i la topologia entre proteïna-proteïna i proteïna-RNA.

5) Estudi estructural de les interaccions protèiques en el proteosoma
Estudi bibliogràfic acompanyat de l'anàlisi computacional. Caracterització de les interaccions entre proteïnes i discussió sobre les funcions de cadascun dels seus membres.

6) Estudi estructural i predictiu de complexos del sistema immunitari

Anàlisi i modelatge de les estructures de IgG i MHC.
Predicció dels centres d'unió en MHC.
Estudi estructural dels pèptids reconeguts per MHC i la seva disposició en les proteïnes.

7) Estudi de la reactivitat de les decarboxilases
Anàlisi comparativa del centre actiu. Determinació dels residus implicats en la reacció. Discussió sobre el mecanisme de reacció de l'enzim.

8) Desenvolupament d'un programa en PERL per ajudar a les iniciatives de Structural Genomics.

Com podries informar els laboratoris experimentals de quines proteïnes poden tenir plegaments nous?
Podries dir-los quines proteïnes són fàcilment modelables per modelatge comparatiu?

9) Estudi del mecanisme dels canals iònics
Discussió oberta.

10) Presentació de parts dels temes 3-16:
Cristal·lografia de proteïnes. Ressonància Magnètica Nuclear. Estructura de DNA, nucleosoma, spliceosoma, estructura de RNA, proteosoma, nucleopore, ribosoma 50S, ribosoma 30S, CdK, ciclines, proteïnes G, adenilat-ciclasa, Tyr-quinasa, Ser-quinasa, MAP quinasa, receptors de membrana, hormones del creixement, rodopsines i proteïnes transmembrana, Aa-t-RNA-Synthase, DNA-polimerasa, RNA-polimerasa, ribonucleasa, helicasa, topoisomerasa, dits de zinc, homeodomains, cremalleres de leucina, carboxipeptidases, serin-proteases, metaloproteases, anells de zinc, ubiquitinació, sintetasa d'oxid nitric (NOS), enzims d'unio a NAD, glutation-reductasa, immunoglobulines, MHC, lipases, glucanases i glucosidases. Encaix proteïna-DNA. Encaix proteïna-proteïna.

BIBLIOGRAFIA
BRANDEN, Carl; TOOZE, John. Introduction to Protein Structure. 2a. ed. Garland Publishing, 1998.
CANTOR; SCHIMMEL. Biophysical Chemistry. WH Freeman & Co, 1980.
DAUNE, M. Molecular Biophysics. Oxford: University Press, 1999.
DRENTH. Principles of Protein X-ray Crystallography. Nova York: Springer-Verlag Inc, 1998.
LEACH, A. Molecular Modelling: Principles and Applications. 2a. ed. Harlow: Pearson Education, 2001.