Llicenciatura en Biologia (3361)

Biologia Estructural(12307) 

IDENTIFICACIÓ DE L’ASSIGNATURA

L’assignatura Biologia Estructural és una matèria obligatòria del currículum de Biologia Humana que s’imparteix al tercer trimestre del tercer curs. Consta de 3 crèdits teòrics i de 6,5 crèdits pràctics.

COORDINACIÓ I PROFESSORAT

El coordinador de l’assignatura és el Dr. Baldomero Oliva. Els doctors Nuria Centeno-Boada, Jordi Villà i Jordi Mestres participaran en la docència.

OBJECTIUS GENERALS

Amb aquesta assignatura es pretén que l’alumne adquireixi coneixements pràctics i teòrics sobre l’estructura proteica i de les biomacromolècules, així com dels mètodes emprats per al seu estudi i caracterització. La matèria que integrarà el present curs comprèn:

- La introducció a les bases biofísiques de sistemes moleculars.

- Els principis estructurals dels biopolímers: proteïnes i DNA.

- La determinació de l’estructura tridimensional de biomolècules.

- La relació estructura/funció de les proteïnes.

- La simulació molecular de proteïnes i DNA.

AVALUACIÓ DELS APRENENTATGES

L’avaluació del rendiment acadèmic es farà segons el barem següent (sobre un total de 10 punts):
Preguntes d'elecció múltiple: 1,5 punts
Preguntes curtes: 2,5 punts
Exercicis de classe: 0,5 punts
Examen de pràctiques: 2,5 punts
Treball de presentació: 3 punts
Qualsevol tipus de còpia dels apartats d’avaluació implica la no-superació de l’assignatura.

REQUERIMENTS

És necessari tenir un coneixement previ de l'assignatura Matemàtiques i Física dels Processos Biològics, impartida durant el primer curs, així com de les assignatures Química Analítica i Farmacèutica i Anàlisi de Drogues i de Medicaments i Bioinformàtica, que s'imparteixen al quart curs de la llicenciatura.

TEMARI TEÒRIC

PART I: INTRODUCCIÓ

Tema 1. Nocions bàsiques de mecànica clàssica i estadística

Conceptes bàsics de mecànica clàssica: forces i energies. Camp de potencial energètic per biomolècules.

Tema 2. Nocions bàsiques de mecànica estadística

Conceptes bàsics de mecànica estadística. L’espai de fase, l’espai conformacional i la funció de partició. Entropia (S), entalpia (H) i energia lliure (G).

Tema 3. Nocions bàsiques de mecànica ondulatòria i electromagnetisme

Nocions de mecànica ondulatòria. El principi de la superposició d’ones. Sèries de Fourier i la transformada de Fourier. Electromagnetisme: lleis de Maxwell. La dualitat de la llum com a ona electromagnètica i com a partícula. Nocions puntuals de mecànica quàntica: operadors i funcions d’ona.  

PART II: PRINCIPI ESTRUCTURAL

Tema 4. Proteïnes: cadena polipeptídica

Els residus aminoàcids i el codi genètic. Seqüència i informació codificada. Blocs conservadors de residus i correlació de mutacions. Homologia i relació seqüencial. Entropia i solvatació. Efecte de clatració i entropia del medi solvent.

Tema 5. Estructura secundària, supersecundària (motius) i terciària

Principis generals del plegament de proteïnes globulars: nucli hidrofòbic i elements d’estructura secundària. L’espai de Ramachandran. L’hèlix alfa. El full beta i la cadena beta. Estructura supersecundària i connexions d’estructures secundàries (llaços).

Tema 6. Dominis tot alfa

Empaquetament d’alfa-hèlixs a 20º i 50º. El domini de four-helix bundle i el seu centre actiu. Plegament globin-like i conservació del nucli hidrofòbic.

Tema 7. Dominis alfa/beta i alfa+beta

El barril a/b. Dominis de full obert a/b. El plegament Rossmann i el centre catalític en plegaments de full obert a/b. Combinacions de regions en a/b i altres regions. Segregació de les regions a i b. Disposició del nucli hidrofòbic dels dominis a+b.

Tema 8. Dominis tot beta

Barril de b meandres ( retinol binding protein). El plegament de b propeller (neuraminidasa). Plegaments de motius greek-key. Estructura del g-cristal·lí i relació entre els exons i els quatre motius greek-key. El sandvitx greek-key. El barril de greek-key i el jelly-roll.

Tema 9. Estructura del DNA

La doble hèlix de DNA. Els solcs major i menor de la doble hèlix. Formes B, A i Z de DNA. La triple hèlix de DNA. Reconeixement de bases de DNA.

PART III: DETERMINACIÓ DE L’ESTRUCTURA

Tema 10. Cristal·lografia de proteïnes i difracció de raigs X

Formes dels cristalls i elements de simetria. Difracció de raigs X en cristalls. Expressió de la intensitat de reflexió. La llei de Bragg. Mapes de densitat electrònica. Factors tèrmics i estructurals de vibració. El problema de les fases. Reemplaçament isomorf únic i múltiple difracció anòmala. Refinament estructural i reemplaçament molecular.

Tema 10c. Mètodes complementaris a la cristal·lografia

Microscòpia electrònica d’alta resolució (HREM). Combinació de mètodes experimentals: HREM + X- ray.

Tema 11. Ressonància magnètica nuclear

El fenomen de la relaxació i l'espín. La ressonància magnètica nuclear: la inducció nuclear, el camp pulsat de radiofreqüència (RF) i el free-induction decay (FID). Nuclear Overhauser Enhancement (NOE). Espectroscòpia de RMN bidimensional. Determinació de l’estructura tridimensional de proteïnes i àcids nucleics mitjançant restriccions de distància.

Tema 11c. Mètodes espectroscòpics complementaris

Espectroscòpia d’infraroigs. Dicroisme circular i percentatges d’estructura secundària. Espectres de massa i encreuament enllaçat o cross-linking de residus.  

Tema 12. Mètodes teòrics alternatius

La classificació de proteïnes i les relacions evolutives de la seqüència. Models ocults de Markov. Xarxes neuronals i predicció d’estructura secundària. Modelatge comparatiu de proteïnes. Teorema del plegament invers. Mètodes de predicció de plegament i threading. Mètodes ab initio i mini-threading.

Tema 13. Anàlisi conformacional de proteïnes

Propietats geomètriques de les proteïnes: distàncies, àrees, moments dipolars. Mètodes de superposició d’estructures terciàries. Definició de l’estructura secundària. Caracterització dels centres actius i centres funcionals. Genoma i proteòmica funcional.

PART IV: ESTRUCTURA/FUNCIÓ

Tema 14. Reconeixement del DNA. Motius helix-turn-helix. Factors de transcripció

Estructura del "lambda Cro" i la seva interacció amb DNA: predicció per modelatge de la interacció. Motius helix-turn-helix, zinc-fingers i leucine-zippers. La transcripció del DNA i els factors de transcripció: famílies amb motius zinc- finger. Homeodominis. Leucine-zippers.

Tema 15. Maquinària de replicació: DNA polimerases, helicases, topoisomerases, etc.

Replicació del DNA. Estructura de la DNA polimerasa I i del fragment Klenow. Estructura d’alguns enzims de restricció i proteïnes estabilitzadores de la cadena senzilla de DNA (SSB). Topoisomerases tipus I i tipus II i l’alliberació de l'estrès torsional del DNA. Transcriptasa inversa. La recombinació del DNA: complex RuvA-RuvB-Holliday junction.

Tema 16. Maquinària de traducció: RNA polimerasa, Aa-t-RNA sintetasa, el ribosoma

Estructura de la RNA polimerasa de E. coli. Estructura de les aminoacil-tRNA sintetases: el domini catalític i el domini que identifica l’anticodó. El ribosoma: subunitats 30S i 50S del ribosoma procariota. Encaixament de les proteïnes del ribosoma en l’estructura de la seqüència 16S de rRNA. La combinació de la difracció de raigs X i la microscòpia electrònica d’alta resolució.  

Tema 17. Enzims amb motius d’unió a nucleòtid

Els processos d’oxidoreducció i els grups prostètics nucleotídics NAD, FAD i FMN. El domini d’unió de NAD: el plegament de Rossmann i la hipòtesi de Rossmann. Transferència estreoespecífica del protó de NADH. El motiu d’unió de nucleòtid NAD-binding. Fusió de gens entre el motiu FMN-binding del barril a/b i el citocrom b5.

Tema 18. Exemples d’enzims catalítics: proteases

La catalització mitjançant enzims. L’estat de transició, el centre actiu i l’encaixament enzim-substrat. Centres específics d’unió a substrat ( subsites). Les serin-proteases: aminoàcids de la tríada catalítica i de l’ oxyanion hole. Metal·loproteases: carboxipeptidases.

Tema 19. Proteïnes del sistema immunitari

Recombinació somàtica implicada en la varietat dels anticossos. Dominis conservats i variables i les regions determinants de la complementarietat. El complex antigen-anticòs. Estructura dels complexos d’histocompatibilitat (MHC): human lymphocyte antigen (HLA). Polimorfismes de la cadena pesada de MHC de classe I.

Tema 20. Proteïnes de membrana

Dificultats en la cristal·lització de les proteïnes de membrana. Hèlixs transmembrana i gràfics d’hidropaticitat de l’estructura primària. Bacteriorodopsina. Centre de reacció fotosintètica de Rhodopseudomonas viridis. Reacció de fotosíntesi, transferència d’energia i efecte túnel. Estructura de les proteïnes b-transmembrana: porines.

Tema 21. Famílies de receptors

Proteïnes G i receptors de factors de creixement. El factor de creixement epidèrmic (EGF) i el seu receptor. L’oncogèn v-erb B. Els receptors d’insulina, EGF i PDGF. Transducció del senyal: tirosina-quinases. L’amplificació del senyal. Estructura de l’adenilat ciclasa. Estructura d’una forma truncada de ras p21 (cH-ras p21). El motiu d’unió a GTP: mutacions implicades en l’activació oncogènica.

PART V: SIMULACIÓ MOLECULAR

Tema 22. Simulacions de metròpolis Monte Carlo i dinàmica molecular

Camps de força moleculars. Algoritmes de diferències finites (Verlet). Simulació per metròpolis Monte Carlo. Simulated Annealing. Efecte del solvent en simulacions de proteïnes. Condicions de contorn i tractament del camp electrostàtic.

Tema 23. Encaixament proteïna-proteïna, proteïna-DNA

Comparació complementària de superfícies. Programes automàtics d’encaixament proteïna-proteïna i proteïna-DNA. Combinació dels mètodes d’encaixament rígid de molècules i de mètodes de simulació molecular.  

Tema 24. El camí del plegament

El problema del plegament i la paradoxa de Levinthal. Aplicació dels models de lattice. Simulació de desplegament. Restriccions definides pels estats de transició de plegament obtinguts per mutagènesi dirigida (funcions f).

TEMARI PRÀCTIC

El programa teòric es complementa amb les pràctiques següents (sessions de dues hores):

Pràctica 1. Introducció a les estacions gràfiques de treball

Primer contacte amb l’estació de treball Silicon Graphics i programes gràfics: RasMol, ModView, Chime, MolMol, Grasp, VMD.

Pràctica 2. Caracterització de motius i estructura secundària

Càlcul dels angles de Ramachandran i visualització d’estructures secundàries d’una proteïna. Ús del DSSP i dels programes de visualització en cintes. Caracterització de motius d’estructura supersecundària (b-hairpin, a-hairpin, b-a-b). Càlculs de superfície i visualització mitjançant Rasmol, Chime, Grasp, MolMol, PyMOL, Molscript.

Pràctica 3. Alineament de seqüències i cerca d’homologia remota

Part 1: Intermediate Séquense Search (ISS). Lineaments múltiples mitjançant ClustalW. Position Specific Substitution Matrix (PSSM). Mètode de cerca mitjançant Psi-Blast.
Part 2: Models ocults de Markov (HMMER). Bases de dades PFAM i SMART.

Pràctica 4. Predicció d’estructura secundària i xarxes neuronals

Mètodes de predicció mitjançant Machine Learning. Com es crea una xarxa neuronal mitjançant SNN. Mètodes de predicció d’estructura secundària.

Pràctica 5. Superposició estructural i caracterització de plegaments

Comparació detallada entre homòlegs, homòlegs remots i anàlegs de diverses proteïnes-problema. Determinació de plegaments clàssics: jelly- roll, TIM- barrel, etc. Estudi detallat de SCOP, CATH i DALI. Superposició d’estructures. Caracterització del tipus de plegament de diverses estructures problema utilitzant els programes d’alineament estructural (CE, SSAP, STAMP) i els programes gràfics.

Pràctica 6. Optimització, Simulated Annealing i dinàmica molecular (sense solvent)

Execució de la simulació en medi no solvent d’una estructura amb GROMOS87. Optimització i dinàmica molecular. Anàlisi conformacional. Simulated Annealing. Aplicació de restriccions de distància. Aplicació amb restriccions de posició.

Pràctica 7. Modelatge comparatiu

Part 1: Cerca de proteïnes homòlogues a la proteïna problema i alineament múltiple per ClustalW. Alineament estructural de les proteïnes homòlogues. Alineament múltiple per Hidden Markov.
Part 2: Modelatge automàtic mitjançant MODELLER.
Part 3: Optimització de l’esquelet polipeptídic. Validació del model mitjançant PROCHECK. Comparació estructural i caracterització del model entre les estructures homòlogues amb les quals aquest es va generar.

Pràctica 8. Predicció estructural (ab initio i threading ) i valoració de l’estructura

Predicció d’estructura secundària per Internet. Estudi predictiu de l’estructura d’una proteïna mitjançant algoritmes de plegament invers, threading i predicció 3D ab initio. Utilització de ProsaII, Threader, TOPITS i 3DPSSM.

Pràctica 9. Simulació per dinàmica molecular amb solvent

Aplicació amb GROMOS96 i medi solvent:
Part 1: Estudi del sistema (proteïna) i construcció de la topologia amb solvent.
Part 2: Optimització i dinàmica amb Periodic Boundary Conditions i restriccions adicionals.
Part 3: Simulated Annealing i dinàmica amb restricció de distància.
Part 4: Anàlisi de la trajectòria: Fluctuacions, RMSD, superfícies i ponts d’hidrogen.

Pràctica 10. Reactivitat enzimàtica

Aplicació de MOLARIS. Estudi del sistema, definició de residus clau i coordenades de reacció. Superfície potencial, estats de transició i intermedis de reacció. Comparació de la reactivitat en aigua i caracterització de la reacció enzimàtica.

TREBALL PRÀCTIC

Aquest treball s'ha de fer per parelles i presentar-lo mitjançant un pòster. El treball es podrà escollir amb una única opció, canviable quan sigui possible, entre les següents:
1) Un programa de càlcul de freqüències d’interacció entre residus i valoració energètica d’un model per a pseudopotencials.
Els potencials estadístics s’han convertit en una de les principals eines de la predicció/validació d’estructures tridimensionals. Aquests potencials es basen en freqüències d’interacció, de manera que la major dificultat d’aquest programa és extreure el major profit de totes les dades estructurals. Aquest programa s’aplicarà al model construït i es valorarà tant el model com el mateix programa. La realització del programa serà tutelada.

2) Cerca de patrons 3D d’unió a grups prostètics

1. Unió a cofactors (NAD, FAD, FMN)
2. Unió a metalls (Zn, Ca, Mg, FE)
3. Unió a substrats petits (GTP, ATP)
4. Unió a macromolècules: DNA, RNA
5. Unió a lípids
6. Unió a glúcids

3) Estudi de la interacció proteïna-proteïna

1. Comprovació de la conservació dels residus en la interacció.
2. Estudi de la disposició 3D entre dominis i dels linkers.
3. Anàlisi del camp de forces en la interacció i en la superfície.
4. Superposició estructural i generació de patrons comparatius entre complexos de proteïnes i dominis de proteïnes.
5. Caracterització estructural de les interaccions i la reactivitat en les cascades de fosforilació.

4) Estudi estructural comparatiu de l’estructura del ribosoma. Anàlisi topològica
Estudi bibliogràfic acompanyat de l’anàlisi computacional. Caracterització de les interaccions i la topologia entre proteïna-proteïna i proteïna-RNA.

5) Estudi estructural de les interaccions proteiques en el proteosoma
Estudi bibliogràfic acompanyat de l’anàlisi computacional. Caracterització de les interaccions entre proteïnes i discussió sobre les funcions de cadascun dels seus membres.

6) Estudi estructural i predictiu de complexos del sistema immunitari

1. Anàlisi i modelatge de les estructures de IgG i MHC.
2. Predicció dels centres d’unió en MHC.
3. Estudi estructural dels pèptids reconeguts per MHC i la seva disposició en les proteïnes.

7) Estudi de la reactivitat de les decarboxilases
Anàlisi comparativa del centre actiu. Determinació dels residus implicats en la reacció. Discussió sobre el mecanisme de reacció de l’enzim.

8) Desenvolupament d'un programa en PERL per ajudar a les iniciatives de Structural Genomics.

1. Com podries informar els laboratoris experimentals de quines proteïnes poden tenir plegaments nous?
2. Podries dir-los quines proteïnes són fàcilment modelables per modelatge comparatiu?

9) Estudi del mecanisme dels canals iònics
Discussió oberta.

BIBLIOGRAFIA

BRANDEN, Carl; TOOZE, John. Introduction to Protein Structure. 2a. ed. Garland Publishing, 1998.
CANTOR; SCHIMMEL. Biophysical Chemistry. WH Freeman & Co, 1980.
DAUNE, M. Molecular Biophysics. Oxford: University Press, 1999.
DRENTH. Principles of Protein X-ray Crystallography. Nova York: Springer-Verlag Inc, 1998.
LEACH, A. Molecular Modelling: Principles and Applications. 2a. ed. Harlow: Pearson Education, 2001.
WUTHRICH, K. NMR of Proteins and Nuclic Acid. 2a. ed. John Wiley & Sons Ltd., 2001.